ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Η μεγαλοβλαστική αναιμία 1 (ΜGΑ1) είναι μια σπάνια αυτοσωμική υποτελής κληρονομική νόσος, που χαρακτηρίζεται από επιλεκτική διαταραχή της απορρόφησης της βιταμίνης Β12 και έχει συχνότητα εμφάνισης 0.8/100,000. Απαντάται συχνότερα σε περιοχές της ανατολικής Μεσογείου, τη Νορβηγία και την Φινλανδία ως σύνδρομο Imerslund-Grasbeck (IGS), στο οποίο εκτός από τη μεγαλοβλαστική αναιμία συνυπάρχει και πρωτεϊνουρία. Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας ανάλυση σύνδεσης σε οικογένειες με ασθενείς των ανωτέρω χωρών, ο τόπος ΜGΑ1 χαρτογραφήθηκε στην περιοχή 10p12.1, ενώ ταυτόχρονα στην ίδια περιοχή, ταυτοποιήθηκε το γονίδιο που ευθύνεται για τη νόσο. Στο γονίδιο αυτό, που ονομάστηκε CUBN, κωδικοποιείται η πρωτείνη κουμπιλίνη. Η κουμπιλίνη είναι ο υποδοχέας που συμμετέχει στην ενδοκυττάρωση του συμπλέγματος ενδογενούς παράγοντα (IF) – βιταμίνης Β12 κατά την διαδικασία της απορρόφησης. Στην παρούσα μελέτη, έγινε μοριακή γενετική ανάλυση στην περιοχή 10p12.1, καθώς και ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο CUBN, σε μια οικογένεια με δύο αδελφάκια που υπήρχε το ενδεχόμενο να νοσούν από IGS, αφού παρουσίαζαν μεγαλοβλαστική αναιμία και πρωτεϊνουρία. Διαπιστώθηκε ότι, ενώ οι δύο γονείς είναι ετεροζυγώτες, τα δύο πάσχοντα αδελφάκια είναι ομοζυγώτες για μια σειρά γενετικούς τόπους στην περιοχή 10p12.1, καθώς και για μια μετάλλαξη στο γονίδιο της κουμπιλίνης, η οποία μάλιστα περιγράφεται για πρώτη φορά στην διεθνή βιβλιογραφία.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η κοβαλαμίνη (βιταμίνη Β12) είναι συνένζυμο των ενζύμων ενδιάμεσου μεταβολισμού συνθετάσης της μεθειονίνης και μεθυλμαλονυλCoA-μουτάσης. Η ανεπάρκεια της Β12 οδηγεί σε δυνητικά θανατηφόρες καταστάσεις, όπως μεγαλοβλαστική αναιμία και αποδιοργάνωση του ΚΝΣ. Οφείλεται κυρίως σε δυσαπορρόφηση της Β12 από το πεπτικό μέσω πολύπλοκων μηχανισμών.
Ο ενδογενής παράγοντας (IF) είναι μία πρωτεΐνη του γαστρικού επιθηλίου. Συνδέεται με την κοβαλαμίνη στον γαστρεντερικό φραγμό και το σύμπλεγμα IF-κοβαλαμίνης αναγνωρίζεται από την κουμπιλίνη, μία πρωτεΐνη που συμμετέχει στην ενδοκυττάρωση του συμπλέγματος.
Το σύνδρομο δυσαπορρόφησης της βιταμίνης Β12 συνδυαζόμενο με πρωτεϊνουρία έχει περιγραφεί αναλυτικά από τους Ιmerslund και Grasbeck ανεξάρτητα, το 19601,2,3. Το σύνδρομο Ιmerslund-Grasbeck (IGS), όπως περιγράφεται στην βιβλιογραφία, είναι μια αυτοσωμική υποτελής κληρονομική νόσος, που εμφανίζεται συνήθως στην βρεφική και παιδική ηλικία, χαρακτηρίζεται δε από χαμηλά επίπεδα κοβαλαμίνης και μέτρια πρωτεϊνουρία. Η διάγνωση επιτυγχάνεται μέσω αποκλεισμού άλλων αιτιών δυσαπορρόφησης της βιταμίνης. Στις αιτίες αυτές συγκαταλέγεται και η ανεπάρκεια του IF (IFD). Σε κλασσική κακοήθη αναιμία, κατά την οποία δεν επαρκεί ο ενδογενής παράγοντας, η χορήγησή του αποκαθιστά την απορρόφηση της βιταμίνης. Με το τεστ Schilling ήταν δυνατός ο έλεγχος της ικανότητας του εντεροκυττάρου να απορροφά το σύμπλεγμα ενδογενούς παράγοντα–κοβαλαμίνης και αποτέλεσε την πλέον διαδεδομένη εργαστηριακή μέθοδο για την εκτίμηση της απορρόφησης της εξωγενώς χορηγουμένης ραδιοκοβαλαμίνης πριν τον δραματικό περιορισμό της χρήσης του λόγω του σχετικά υψηλού κόστους και της δύσκολης κάποιες φορές αξιολόγησης των τιμών απορρόφησης της ραδιοκοβαλαμίνης.
Το σύνδρομο ΙG (ΜGA1) είναι μια σπάνια οντότητα, η οποία διαπιστώθηκε και μελετήθηκε για πρώτη φορά σε ασθενείς της Φινλανδίας και της Νορβηγίας. Εχουν αναφερθεί παγκοσμίως περί τους 250 ασθενείς. Το σύνδρομο αποδίδεται σε μεταλλάξεις γονιδίων που συμμετέχουν στην απορρόφηση του συμπλέγματος IF-κοβαλαμίνης. Στην Φινλανδία οι μεταλλάξεις αφορούσαν μόνο το γονίδιο της κουμπιλίνης (CUBN) που έχει εντοπιστεί στο χρωμόσωμα 10ρ12.1 και έχει διαπιστωθεί ότι σε αυτό κωδικοποιείται ο υποδοχέας για το σύμπλεγμα IF-κοβαλαμίνης. Στη Νορβηγία, σε ασθενείς με τον ίδιο φαινότυπο, το σύνδρομο αποδόθηκε σε μεταλλάξεις του γονιδίου amnionless. Αμφότερες οι πρωτείνες που παράγονται συμμετέχουν στην διαδικασία απορρόφησης του εντέρου, καθώς και στη νεφρική σωληναριακή επαναρρόφηση, με ένα μηχανισμό ο οποίος δεν έχει αποσαφηνιστεί μέχρι σήμερα. Οι πρωτεΐνες αυτές συνιστούν το ετεροδιμερές σύμπλοκο cubam, που συμβάλλει στον τρόπο συμπεριφοράς και στη λειτουργικότητα του συμπλέγματος IF-κοβαλαμίνης. Οι ερευνητές που έχουν ασχοληθεί με τις μεταλλάξεις αυτές βρήκαν ότι η συχνότητα της νόσου δείχνει να μειώνεται στις επόμενες γενιές, υποστηρίζοντας ότι στην εμφάνιση της νόσου ενδέχεται να συμβάλλουν περιβαλλοντικοί και διαιτητικοί παράγοντες. Πρόσφατα περιγράφηκαν περιστατικά ασθενών και οικογενειών με ΙFD ποικίλων εθνικοτήτων, κυρίως από την περιοχή της Μεσογείου, οι οποίοι παρουσίαζαν μεταλλάξεις, είτε στο γονίδιο της κουμπιλίνης, είτε στο γονίδιο amnionless. Σε κάποιες οικογένειες δεν στάθηκε δυνατό να διαπιστωθούν μεταλλάξεις στα γονίδια αυτά γεννώντας ερωτήματα σχετικά με την αλληλεπίδραση περιβάλλοντος – γενετικού υλικού, καθώς και με την εμφάνιση γενετικής ετερογένειας. Αποτέλεσμα των μεταλλάξεων είναι και η παραγωγή ειδικών «υποφωτισμένων» πρωτεινών (moon-lighting proteins) των οποίων η λειτουργικότητα ποικίλει ανάλογα με το είδος των εμπλεκομένων κυττάρων, την τοπογραφία του ιστού, την θέση πρόσδεσης της πρωτείνης, καθώς και άλλες ειδικές συνθήκες.
Στην περίπτωσή μας, σε δύο αδελφάκια με μεγαλοβλαστική αναιμία και πρωτεϊνουρία μελετήθηκε γενετικό υλικό με σκοπό την ακριβή διάγνωση, την ερμηνεία της υποκείμενης πάθησης και την ορθή θεραπευτική αντιμετώπισή της. Ανιχνεύσαμε λοιπόν μια νέα μετάλλαξη του γονιδίου της κουμπιλίνης, στην οποία φαίνεται να οφείλεται ο φαινότυπος του συνδρόμου ΙGS, στα συγκεκριμένα περιστατικά. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, σε πολλά περιστατικά δεν είναι γνωστό αν η εμφάνιση του συνδρόμου οφείλεται σε μετάλλαξη στο γονίδιο της κουμπιλίνης, του ενδογενούς παράγοντα ή του γονιδίου amnionless. Πιστεύουμε λοιπόν, ότι σε περιπτώσεις ασθενών που υποψιαζόμαστε συγγενή νεανική ανεπάρκεια κοβαλαμίνης, η διάγνωση θα πρέπει να τεκμηριώνεται με μοριακή γενετική ανάλυση για την ταυτοποίηση της νοσολογικής οντότητας και την ορθότερη αντιμετώπιση κάθε περιστατικού.
ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
Ασθενείς
Μελετήθηκαν δύο αδελφάκια Αλβανικής καταγωγής, ηλικίας 6 και 4 ετών, αγόρι και κορίτσι αντιστοίχως, στα οποία από έτους είχε διαπιστωθεί πρωτεϊνουρία και αναιμία σε διαφορετικό βαθμό για έκαστο αυτών. Οι γονείς ανέφεραν ότι η αναιμία απασχολούσε από βρεφικής ηλικίας και τα δύο, χωρίς περισσότερες πληροφορίες. Στην οικογένεια αναφέρθηκε άλλο ένα αδελφάκι, το οποίο απεβίωσε στην ηλικία των 18 μηνών, ενώ είχε μεταγγισθεί ήδη δύο φορές. Μετά την καταγραφή του φαινοτύπου, την εκτέλεση των καταλλήλων εργαστηριακών αναλύσεων και τη λήψη σχετικής συγκατάθεσης εκ μέρους των γονέων, έγινε δειγματοληψία περιφερικού αίματος και μυελού των οστών από τα νοσούντα παιδιά, καθώς και περιφερικού αίματος από τους γονείς για απομόνωση γονιδιωματικού DNA.
Απομόνωση γονιδιωματικού DNA
Γονιδιωματικό DΝΑ απομονώθηκε από μυελό και/ή περιφερικό αίμα των ασθενών και των γονέων τους, για περαιτέρω μελέτη. Για την απομόνωση DNA χρησιμοποιήθηκε kit της QIAGEN σύμφωνα με τις υποδείξεις της κατασκευάστριας εταιρείας (Chatsworth,CA).
Ανάλυση γονοτύπου
Για την ανάλυση γονοτύπου στην χρωμοσωμική περιοχή 10p12.1, στην οποία εδράζεται το γονίδιο CUBN, χρησιμοποιήθηκαν οι μικροδορυφορικοί δείκτες επαναλήψεων CA, D10S1653 (~1.2 Mb τελομερικά), D10S1661 (~160 kb τελομερικά), AFM234ZF10 (~140 kb κεντρομερικά) και D10S548 (~1.3 Mb κεντρομερικά), πλευρικοί του γονιδίου CUBN, καθώς και οι ενδογονιδιακοί δείκτες επαναλήψεων CA, CUBN M2 (ιντρόνιο 28) και CUBN M3 (ιντρόνιο 66). Οι μικροδορυφορικοί δείκτες επαναλήψεων CA μελετήθηκαν σε Γενετικό Αναλυτή ABI Prism 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
PCR-SSCP και αλληλούχιση
Μεμονωμένα εξώνια του γονιδίου της κουμπιλίνης (CUBN) (GenBank RefSeq: NM_001081.2) ενισχύθηκαν από γονιδιωματικό DΝΑ με την τεχνική της PCR και το προϊόν της PCR αναλύθηκε με την τεχνική SSCP (Πολυμορφισμού Διαμόρφωσης Μονόκλωνου DNA – Single Strand Conformation Polymorphism). Στη συνέχεια, τα δείγματα που εμφάνισαν ανώμαλο ηλεκτροφορητικό τύπο στην τεχνική SSCP, μελετήθηκαν περαιτέρω με αλληλούχιση των προϊόντων της PCR. Για την αλληλούχιση χρησιμοποιήθηκε κατάλληλο kit της Applied Biosystems, ενώ η ανάλυση των προϊόντων της αλληλούχισης έγινε με την βοήθεια Γενετικού Αναλυτή ABI Prism 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Φαινότυπος και κλινικοεργαστηριακά στοιχεία
Ο ασθενής 1 ήταν αγόρι ηλικίας 6 ετών με ιστορικό μετάγγισης ερυθρών σε ηλικία 2,5 και 3,5 ετών. Από έτους απασχολούσαν συχνές λοιμώξεις, ανορεξία, ανεπαρκής πρόσληψη βάρους και πρωτεϊνουρία. Κατά την παρακολούθηση και τον έλεγχο της πρωτεϊνουρίας, εμφάνιζε βαρειά μακροκυτταρική αναιμία, καταβολή, γλωσσίτιδα, χειλίτιδα, τριχόπτωση, ίκτερο και διαταραχές συμπεριφοράς, χωρίς όμως νευρολογικά ευρήματα. Ο ασθενής 2 ήταν κορίτσι ηλικίας 4 ετών, το οποίο σε ηλικία 7 μηνών μεταγγίσθηκε. Ήπια πρωτεϊνουρία εμφανίσθηκε στην ηλικία των 3,5 ετών, χωρίς άλλη συμπτωματολογία όλο αυτό το διάστημα. Κατά την περίοδο της διάγνωσης παρουσίαζε μέτρια μακροκυτταρική αναιμία. Τα δύο παιδιά υπεβλήθησαν σε πλήρη κλινικοεργαστηριακό έλεγχο, ο οποίος παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Μεταξύ άλλων, ο έλεγχος περιελάμβανε μυελόγραμμα και στα δύο .
Ανάλυση γονοτύπου
Χρησιμοποιώντας δείγματα γονιδιωματικού DNA από τους γονείς και τα νοσούντα παιδιά έγινε ανάλυση γονοτύπου για το σύνδρομο Imerslund – Grasbeck στην ευρύτερη περιοχή του γονιδίου της κουμπιλίνης (CUBN), στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 10. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν ως μικροδορυφορικοί δείκτες πολυμορφικές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες CA (Εικόνα 2). Οι γενετικοί τόποι CUBN M2 και CUBN M3 είναι ενδογονιδιακοί δείκτες, ενώ οι υπόλοιποι βρίσκονται σε περιοχές πλευρικές του γονιδίου, και συγκεκριμένα οι D10S1653 και D10S1661 τελομερικά, ενώ οι AFM234ZF10 και D10S548 κεντρομερικά. Το μέγεθος των διαφορετικών αλληλομόρφων των μικροδορυφορικών δεικτών ταυτοποιήθηκε μετά από PCR και αλληλούχιση των προϊόντων της PCR. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης παρουσιάζονται στην εικόνα 3. Επί μη υπαρχόντων στοιχείων σημειώνεται 0. Διαπιστώθηκε ότι οι γονείς ήταν ετεροζυγώτες για όλους τους μικροδορυφορικούς δείκτες της περιοχής 10p12.1 που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ τα δύο πάσχοντα παιδιά ήταν ομοζυγώτες για όλους τους δείκτες της ίδιας περιοχής.
Ανάλυση μεταλλάξεων
Χρησιμοποιώντας τα παραπάνω δείγματα, έγινε ανίχνευση μεταλλάξεων σε εξώνια του γονιδίου CUBN, για να διαπιστωθεί αν οι ασθενείς που ενδεχομένως έπασχαν από το σύνδρομο Imerslund – Grasbeck, έφεραν δομικές αλλαγές στο γονίδιο αυτό. Βρέθηκε ότι οι γονείς ήταν ετεροζυγωτικοί φορείς, ενώ τα νοσούντα παιδιά ήταν ομοζυγώτες για μια νέα μετάλλαξη, η οποία περιγράφεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία. Είναι μια σημειακή μετάλλαξη ανταλλαγής ζεύγους βάσεων στη θέση 2594 της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδίου CUBN, που βρίσκεται στο εξώνιο 19, όπου μια γουανίνη (G) αντικαθίσταται από μια αδενίνη (A). Η αλλαγή c2594G>A στο εσωτερικό του εξωνίου 19 οδηγεί στην αλλαγή Ser865Asn σε επίπεδο αμινοξικής αλληλουχίας, γεγονός που τροποποιεί ένα συντηρημένο αμινοξύ στον τομέα CUB4 της πρωτείνης. Από τα παραπάνω στοιχεία φαίνεται ότι η μετάλλαξη αυτή είναι η γενεσιουργός αιτία της νόσου στα συγκεκριμένα περιστατικά.
ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Στην εργασία αυτή, η ανάλυση γονοτύπου έδειξε ότι οι γονείς φέρουν ένα ταυτόσημο χρωμοσωμικό τμήμα στην περιοχή 10p12.1, για το οποίο είναι και οι δύο ετεροζυγώτες. Η ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο CUBN, το οποίο εδράζεται στην περιοχή 10p12.1, έδειξε ότι οι δύο γονείς είναι ετεροζυγώτες για την ίδια μετάλλαξη c2594G>A στο εξώνιο 19, η οποία οδηγεί στην σημαντική, σε επίπεδο αμινοξικής αλληλουχίας, αλλαγή Ser865Asn. Σε ό,τι αφορά στα πάσχοντα παιδιά, η μοριακή γενετική ανάλυση έδειξε ότι και τα δύο είναι ομοζυγώτες για μια σειρά μικροδορυφορικών δεικτών στην περιοχή 10p12.1, ενώ ταυτόχρονα είναι ομοζυγώτες για τη μετάλλαξη c2594G>A στο εξώνιο 19 του γονιδίου CUBN. Από τα παραπάνω, μπορούμε να συνάγουμε αφενός ότι η μετάλλαξη c2594G>A στο γονίδιο CUBN είναι η γενεσιουργός αιτία της νόσου στα περιστατικά αυτά, αφετέρου ότι οι γονείς των πασχόντων παιδιών κληρονόμησαν την χρωμοσωμική περιοχή 10p12.1 από κάποιον κοινό πρόγονο. Οι μεταλλάξεις που έχουν ανιχνευθεί στο γονίδιο CUBN παίζουν σημαντικό ρόλο στα επίπεδα έκφρασης, την λειτουργικότητα και την σταθερότητα της πρωτείνης, λόγω αλλαγών σε σημαντικά συντηρημένα αμινοξέα ή στον ρυθμό αποδόμησης του mRNA ή της ίδιας της πρωτείνης. Για να εκτιμηθεί ο ρόλος τον οποίον παίζει στην αιτιοπαθογένεια της νόσου η συγκεκριμένη μετάλλαξη που αναφέρουμε για πρώτη φορά σε αυτή την εργασία, έχουν αναληφθεί περαιτέρω μελέτες που βρίσκονται σε εξέλιξη.
Η μελέτη μεγάλων αριθμών ασθενών με νεανική μεγαλοβλαστική αναιμία είναι σημαντική προϋπόθεση προκειμένου να προσδιοριστεί η συμβολή της υποκείμενης μετάλλαξης στον φαινότυπο, καθώς και να γίνει δυνατή η επιτυχής διάκριση του κληρονομούμενου από τον επίκτητο τύπο της νόσου. Οι Tanner και συνεργάτες αναφέρουν έναν αριθμό 55 οικογενειών και σποραδικών ασθενών που παραπέμφθηκαν για ανάλυση μεταλλάξεων στηριζόμενοι σε κλινική υποψία κληρονομικής ανεπαρκείας της κοβαλαμίνης. Από αυτούς, μόνον οι 6 δεν είχαν μεταλλάξεις, γεγονός που οδήγησε στην ερμηνεία ότι η αποτυχία ανίχνευσης μετάλλαξης πιθανά συνεπάγεται επίκτητο τύπο ανεπαρκείας, ενδεχομένως και με διαφορετική μοριακή βάση.
Η παρούσα μελέτη περιγράφει τη διαφορική διάγνωση του συνδρόμου IGS από το οποίο φαίνεται ότι πάσχουν δύο αδελφάκια με μεγαλοβλαστική αναιμία και πρωτεϊνουρία, χρησιμοποιώντας μοριακή γενετική ανάλυση. Η εργασία αυτή συμβάλλει στην ταυτοποίηση της αιτιοπαθογένειας της νόσου με την καθιέρωση μιας νέας στρατηγικής η οποία αντιμετωπίζει το πρόβλημα της διαφορικής διάγνωσης μεταξύ συνδρόμων που εμφανίζουν όμοια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως η πάθηση από ανεπάρκεια του ενδογενή παράγοντα (IFD) και το σύνδρομο ΙGS, ενώ γενετικά και βιοχημικά αποτελούν διαφορετικές οντότητες. Η διαφορική διάγνωση θα μπορούσε να γίνει με το τεστ Schilling, εφ’ όσον βέβαια πληρούνταν οι προϋποθέσεις αξιοπιστίας της μεθόδου, όπως ο αποκλεισμός άλλων συνδρόμων δυσαπορρόφησης, ειδικών λοιμώξεων, ειδικών διατροφικών συνηθειών και ειδικών καταστάσεων όπως σύνδρομο τυφλής έλικας. Όμως, το σχετικά υψηλό κόστος της τεχνικής καθώς και η δύσκολη κάποιες φορές αξιολόγηση των τιμών απορρόφησης της ραδιοκοβαλαμίνης έχουν περιορίσει ή σχεδόν καταργήσει την χρήση της στις περισσότερες χώρες.
Με τη χρήση της μεθόδου μοριακής διάγνωσης είναι πολύ πιθανό να αποδειχθεί ότι αμφότερα τα σύνδρομα ΙGS και ΙFD παρουσιάζουν συχνότητα εμφάνισης υψηλότερη αυτής που πιστεύεται. Ακόμα περισσότερο μάλιστα σε πληθυσμούς όπου οι γάμοι μεταξύ συγγενών είναι συχνοί. Κάτι σχετικό φαίνεται πως συμβαίνει στην οικογένεια με την οποία ασχοληθήκαμε στην παρούσα εργασία. Η παρουσία ενός εκτεταμένου τμήματος της περιοχής 10p12.1 σε ετεροζυγωτία και στους δύο γονείς, κάνει ιδιαίτερα πιθανό το ενδεχόμενο της κληρονόμησης του τμήματος αυτού από κάποιον κοινό πρόγονο, γεγονός που σημαίνει πως οι γονείς ήταν συγγενείς.
Παρ’ όλον ότι οι φαινοτυπικά όμοιες ανωτέρω παθολογικές καταστάσεις μπορούν εύκολα να αποκατασταθούν με την χορήγηση βιταμίνης Β12, εξακολουθεί να μην υπάρχει ακριβής διάγνωση γι’ αυτές. Όμως, η ερευνητική δραστηριότητα στο πεδίο της μοριακής διάγνωσης, στα πλαίσια της οποίας εντάσσεται και η παρούσα εργασία, συμβάλλει στην ανάπτυξη γενετικών τεστ, τα οποία παίζουν αποφασιστικό ρόλο στην άμεση και ασφαλή διάγνωση, αφού κάνουν δυνατή την ταυτοποίηση των διαταραχών σε μοριακό επίπεδο. Τέτοιου είδους ευρήματα αποτελούν σημαντικές πληροφορίες για τους κλινικούς γιατρούς, σε ότι αφορά στον καλύτερο θεραπευτικό χειρισμό κάθε περιστατικού, αφού η γρήγορη και σωστή διάγνωση μπορεί να τροποποιήσει τον χρόνο έναρξης αλλά και την θεραπεία με κοβαλαμίνη στο σύνολό της.
Πάνος Πουλόπουλος
Η μεγαλοβλαστική αναιμία 1 (ΜGΑ1) είναι μια σπάνια αυτοσωμική υποτελής κληρονομική νόσος, που χαρακτηρίζεται από επιλεκτική διαταραχή της απορρόφησης της βιταμίνης Β12 και έχει συχνότητα εμφάνισης 0.8/100,000. Απαντάται συχνότερα σε περιοχές της ανατολικής Μεσογείου, τη Νορβηγία και την Φινλανδία ως σύνδρομο Imerslund-Grasbeck (IGS), στο οποίο εκτός από τη μεγαλοβλαστική αναιμία συνυπάρχει και πρωτεϊνουρία. Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας ανάλυση σύνδεσης σε οικογένειες με ασθενείς των ανωτέρω χωρών, ο τόπος ΜGΑ1 χαρτογραφήθηκε στην περιοχή 10p12.1, ενώ ταυτόχρονα στην ίδια περιοχή, ταυτοποιήθηκε το γονίδιο που ευθύνεται για τη νόσο. Στο γονίδιο αυτό, που ονομάστηκε CUBN, κωδικοποιείται η πρωτείνη κουμπιλίνη. Η κουμπιλίνη είναι ο υποδοχέας που συμμετέχει στην ενδοκυττάρωση του συμπλέγματος ενδογενούς παράγοντα (IF) – βιταμίνης Β12 κατά την διαδικασία της απορρόφησης. Στην παρούσα μελέτη, έγινε μοριακή γενετική ανάλυση στην περιοχή 10p12.1, καθώς και ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο CUBN, σε μια οικογένεια με δύο αδελφάκια που υπήρχε το ενδεχόμενο να νοσούν από IGS, αφού παρουσίαζαν μεγαλοβλαστική αναιμία και πρωτεϊνουρία. Διαπιστώθηκε ότι, ενώ οι δύο γονείς είναι ετεροζυγώτες, τα δύο πάσχοντα αδελφάκια είναι ομοζυγώτες για μια σειρά γενετικούς τόπους στην περιοχή 10p12.1, καθώς και για μια μετάλλαξη στο γονίδιο της κουμπιλίνης, η οποία μάλιστα περιγράφεται για πρώτη φορά στην διεθνή βιβλιογραφία.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η κοβαλαμίνη (βιταμίνη Β12) είναι συνένζυμο των ενζύμων ενδιάμεσου μεταβολισμού συνθετάσης της μεθειονίνης και μεθυλμαλονυλCoA-μουτάσης. Η ανεπάρκεια της Β12 οδηγεί σε δυνητικά θανατηφόρες καταστάσεις, όπως μεγαλοβλαστική αναιμία και αποδιοργάνωση του ΚΝΣ. Οφείλεται κυρίως σε δυσαπορρόφηση της Β12 από το πεπτικό μέσω πολύπλοκων μηχανισμών.
Ο ενδογενής παράγοντας (IF) είναι μία πρωτεΐνη του γαστρικού επιθηλίου. Συνδέεται με την κοβαλαμίνη στον γαστρεντερικό φραγμό και το σύμπλεγμα IF-κοβαλαμίνης αναγνωρίζεται από την κουμπιλίνη, μία πρωτεΐνη που συμμετέχει στην ενδοκυττάρωση του συμπλέγματος.
Το σύνδρομο δυσαπορρόφησης της βιταμίνης Β12 συνδυαζόμενο με πρωτεϊνουρία έχει περιγραφεί αναλυτικά από τους Ιmerslund και Grasbeck ανεξάρτητα, το 19601,2,3. Το σύνδρομο Ιmerslund-Grasbeck (IGS), όπως περιγράφεται στην βιβλιογραφία, είναι μια αυτοσωμική υποτελής κληρονομική νόσος, που εμφανίζεται συνήθως στην βρεφική και παιδική ηλικία, χαρακτηρίζεται δε από χαμηλά επίπεδα κοβαλαμίνης και μέτρια πρωτεϊνουρία. Η διάγνωση επιτυγχάνεται μέσω αποκλεισμού άλλων αιτιών δυσαπορρόφησης της βιταμίνης. Στις αιτίες αυτές συγκαταλέγεται και η ανεπάρκεια του IF (IFD). Σε κλασσική κακοήθη αναιμία, κατά την οποία δεν επαρκεί ο ενδογενής παράγοντας, η χορήγησή του αποκαθιστά την απορρόφηση της βιταμίνης. Με το τεστ Schilling ήταν δυνατός ο έλεγχος της ικανότητας του εντεροκυττάρου να απορροφά το σύμπλεγμα ενδογενούς παράγοντα–κοβαλαμίνης και αποτέλεσε την πλέον διαδεδομένη εργαστηριακή μέθοδο για την εκτίμηση της απορρόφησης της εξωγενώς χορηγουμένης ραδιοκοβαλαμίνης πριν τον δραματικό περιορισμό της χρήσης του λόγω του σχετικά υψηλού κόστους και της δύσκολης κάποιες φορές αξιολόγησης των τιμών απορρόφησης της ραδιοκοβαλαμίνης.
Το σύνδρομο ΙG (ΜGA1) είναι μια σπάνια οντότητα, η οποία διαπιστώθηκε και μελετήθηκε για πρώτη φορά σε ασθενείς της Φινλανδίας και της Νορβηγίας. Εχουν αναφερθεί παγκοσμίως περί τους 250 ασθενείς. Το σύνδρομο αποδίδεται σε μεταλλάξεις γονιδίων που συμμετέχουν στην απορρόφηση του συμπλέγματος IF-κοβαλαμίνης. Στην Φινλανδία οι μεταλλάξεις αφορούσαν μόνο το γονίδιο της κουμπιλίνης (CUBN) που έχει εντοπιστεί στο χρωμόσωμα 10ρ12.1 και έχει διαπιστωθεί ότι σε αυτό κωδικοποιείται ο υποδοχέας για το σύμπλεγμα IF-κοβαλαμίνης. Στη Νορβηγία, σε ασθενείς με τον ίδιο φαινότυπο, το σύνδρομο αποδόθηκε σε μεταλλάξεις του γονιδίου amnionless. Αμφότερες οι πρωτείνες που παράγονται συμμετέχουν στην διαδικασία απορρόφησης του εντέρου, καθώς και στη νεφρική σωληναριακή επαναρρόφηση, με ένα μηχανισμό ο οποίος δεν έχει αποσαφηνιστεί μέχρι σήμερα. Οι πρωτεΐνες αυτές συνιστούν το ετεροδιμερές σύμπλοκο cubam, που συμβάλλει στον τρόπο συμπεριφοράς και στη λειτουργικότητα του συμπλέγματος IF-κοβαλαμίνης. Οι ερευνητές που έχουν ασχοληθεί με τις μεταλλάξεις αυτές βρήκαν ότι η συχνότητα της νόσου δείχνει να μειώνεται στις επόμενες γενιές, υποστηρίζοντας ότι στην εμφάνιση της νόσου ενδέχεται να συμβάλλουν περιβαλλοντικοί και διαιτητικοί παράγοντες. Πρόσφατα περιγράφηκαν περιστατικά ασθενών και οικογενειών με ΙFD ποικίλων εθνικοτήτων, κυρίως από την περιοχή της Μεσογείου, οι οποίοι παρουσίαζαν μεταλλάξεις, είτε στο γονίδιο της κουμπιλίνης, είτε στο γονίδιο amnionless. Σε κάποιες οικογένειες δεν στάθηκε δυνατό να διαπιστωθούν μεταλλάξεις στα γονίδια αυτά γεννώντας ερωτήματα σχετικά με την αλληλεπίδραση περιβάλλοντος – γενετικού υλικού, καθώς και με την εμφάνιση γενετικής ετερογένειας. Αποτέλεσμα των μεταλλάξεων είναι και η παραγωγή ειδικών «υποφωτισμένων» πρωτεινών (moon-lighting proteins) των οποίων η λειτουργικότητα ποικίλει ανάλογα με το είδος των εμπλεκομένων κυττάρων, την τοπογραφία του ιστού, την θέση πρόσδεσης της πρωτείνης, καθώς και άλλες ειδικές συνθήκες.
Στην περίπτωσή μας, σε δύο αδελφάκια με μεγαλοβλαστική αναιμία και πρωτεϊνουρία μελετήθηκε γενετικό υλικό με σκοπό την ακριβή διάγνωση, την ερμηνεία της υποκείμενης πάθησης και την ορθή θεραπευτική αντιμετώπισή της. Ανιχνεύσαμε λοιπόν μια νέα μετάλλαξη του γονιδίου της κουμπιλίνης, στην οποία φαίνεται να οφείλεται ο φαινότυπος του συνδρόμου ΙGS, στα συγκεκριμένα περιστατικά. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, σε πολλά περιστατικά δεν είναι γνωστό αν η εμφάνιση του συνδρόμου οφείλεται σε μετάλλαξη στο γονίδιο της κουμπιλίνης, του ενδογενούς παράγοντα ή του γονιδίου amnionless. Πιστεύουμε λοιπόν, ότι σε περιπτώσεις ασθενών που υποψιαζόμαστε συγγενή νεανική ανεπάρκεια κοβαλαμίνης, η διάγνωση θα πρέπει να τεκμηριώνεται με μοριακή γενετική ανάλυση για την ταυτοποίηση της νοσολογικής οντότητας και την ορθότερη αντιμετώπιση κάθε περιστατικού.
ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
Ασθενείς
Μελετήθηκαν δύο αδελφάκια Αλβανικής καταγωγής, ηλικίας 6 και 4 ετών, αγόρι και κορίτσι αντιστοίχως, στα οποία από έτους είχε διαπιστωθεί πρωτεϊνουρία και αναιμία σε διαφορετικό βαθμό για έκαστο αυτών. Οι γονείς ανέφεραν ότι η αναιμία απασχολούσε από βρεφικής ηλικίας και τα δύο, χωρίς περισσότερες πληροφορίες. Στην οικογένεια αναφέρθηκε άλλο ένα αδελφάκι, το οποίο απεβίωσε στην ηλικία των 18 μηνών, ενώ είχε μεταγγισθεί ήδη δύο φορές. Μετά την καταγραφή του φαινοτύπου, την εκτέλεση των καταλλήλων εργαστηριακών αναλύσεων και τη λήψη σχετικής συγκατάθεσης εκ μέρους των γονέων, έγινε δειγματοληψία περιφερικού αίματος και μυελού των οστών από τα νοσούντα παιδιά, καθώς και περιφερικού αίματος από τους γονείς για απομόνωση γονιδιωματικού DNA.
Απομόνωση γονιδιωματικού DNA
Γονιδιωματικό DΝΑ απομονώθηκε από μυελό και/ή περιφερικό αίμα των ασθενών και των γονέων τους, για περαιτέρω μελέτη. Για την απομόνωση DNA χρησιμοποιήθηκε kit της QIAGEN σύμφωνα με τις υποδείξεις της κατασκευάστριας εταιρείας (Chatsworth,CA).
Ανάλυση γονοτύπου
Για την ανάλυση γονοτύπου στην χρωμοσωμική περιοχή 10p12.1, στην οποία εδράζεται το γονίδιο CUBN, χρησιμοποιήθηκαν οι μικροδορυφορικοί δείκτες επαναλήψεων CA, D10S1653 (~1.2 Mb τελομερικά), D10S1661 (~160 kb τελομερικά), AFM234ZF10 (~140 kb κεντρομερικά) και D10S548 (~1.3 Mb κεντρομερικά), πλευρικοί του γονιδίου CUBN, καθώς και οι ενδογονιδιακοί δείκτες επαναλήψεων CA, CUBN M2 (ιντρόνιο 28) και CUBN M3 (ιντρόνιο 66). Οι μικροδορυφορικοί δείκτες επαναλήψεων CA μελετήθηκαν σε Γενετικό Αναλυτή ABI Prism 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
PCR-SSCP και αλληλούχιση
Μεμονωμένα εξώνια του γονιδίου της κουμπιλίνης (CUBN) (GenBank RefSeq: NM_001081.2) ενισχύθηκαν από γονιδιωματικό DΝΑ με την τεχνική της PCR και το προϊόν της PCR αναλύθηκε με την τεχνική SSCP (Πολυμορφισμού Διαμόρφωσης Μονόκλωνου DNA – Single Strand Conformation Polymorphism). Στη συνέχεια, τα δείγματα που εμφάνισαν ανώμαλο ηλεκτροφορητικό τύπο στην τεχνική SSCP, μελετήθηκαν περαιτέρω με αλληλούχιση των προϊόντων της PCR. Για την αλληλούχιση χρησιμοποιήθηκε κατάλληλο kit της Applied Biosystems, ενώ η ανάλυση των προϊόντων της αλληλούχισης έγινε με την βοήθεια Γενετικού Αναλυτή ABI Prism 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Φαινότυπος και κλινικοεργαστηριακά στοιχεία
Ο ασθενής 1 ήταν αγόρι ηλικίας 6 ετών με ιστορικό μετάγγισης ερυθρών σε ηλικία 2,5 και 3,5 ετών. Από έτους απασχολούσαν συχνές λοιμώξεις, ανορεξία, ανεπαρκής πρόσληψη βάρους και πρωτεϊνουρία. Κατά την παρακολούθηση και τον έλεγχο της πρωτεϊνουρίας, εμφάνιζε βαρειά μακροκυτταρική αναιμία, καταβολή, γλωσσίτιδα, χειλίτιδα, τριχόπτωση, ίκτερο και διαταραχές συμπεριφοράς, χωρίς όμως νευρολογικά ευρήματα. Ο ασθενής 2 ήταν κορίτσι ηλικίας 4 ετών, το οποίο σε ηλικία 7 μηνών μεταγγίσθηκε. Ήπια πρωτεϊνουρία εμφανίσθηκε στην ηλικία των 3,5 ετών, χωρίς άλλη συμπτωματολογία όλο αυτό το διάστημα. Κατά την περίοδο της διάγνωσης παρουσίαζε μέτρια μακροκυτταρική αναιμία. Τα δύο παιδιά υπεβλήθησαν σε πλήρη κλινικοεργαστηριακό έλεγχο, ο οποίος παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Μεταξύ άλλων, ο έλεγχος περιελάμβανε μυελόγραμμα και στα δύο .
Ανάλυση γονοτύπου
Χρησιμοποιώντας δείγματα γονιδιωματικού DNA από τους γονείς και τα νοσούντα παιδιά έγινε ανάλυση γονοτύπου για το σύνδρομο Imerslund – Grasbeck στην ευρύτερη περιοχή του γονιδίου της κουμπιλίνης (CUBN), στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 10. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν ως μικροδορυφορικοί δείκτες πολυμορφικές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες CA (Εικόνα 2). Οι γενετικοί τόποι CUBN M2 και CUBN M3 είναι ενδογονιδιακοί δείκτες, ενώ οι υπόλοιποι βρίσκονται σε περιοχές πλευρικές του γονιδίου, και συγκεκριμένα οι D10S1653 και D10S1661 τελομερικά, ενώ οι AFM234ZF10 και D10S548 κεντρομερικά. Το μέγεθος των διαφορετικών αλληλομόρφων των μικροδορυφορικών δεικτών ταυτοποιήθηκε μετά από PCR και αλληλούχιση των προϊόντων της PCR. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης παρουσιάζονται στην εικόνα 3. Επί μη υπαρχόντων στοιχείων σημειώνεται 0. Διαπιστώθηκε ότι οι γονείς ήταν ετεροζυγώτες για όλους τους μικροδορυφορικούς δείκτες της περιοχής 10p12.1 που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ τα δύο πάσχοντα παιδιά ήταν ομοζυγώτες για όλους τους δείκτες της ίδιας περιοχής.
Ανάλυση μεταλλάξεων
Χρησιμοποιώντας τα παραπάνω δείγματα, έγινε ανίχνευση μεταλλάξεων σε εξώνια του γονιδίου CUBN, για να διαπιστωθεί αν οι ασθενείς που ενδεχομένως έπασχαν από το σύνδρομο Imerslund – Grasbeck, έφεραν δομικές αλλαγές στο γονίδιο αυτό. Βρέθηκε ότι οι γονείς ήταν ετεροζυγωτικοί φορείς, ενώ τα νοσούντα παιδιά ήταν ομοζυγώτες για μια νέα μετάλλαξη, η οποία περιγράφεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία. Είναι μια σημειακή μετάλλαξη ανταλλαγής ζεύγους βάσεων στη θέση 2594 της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γονιδίου CUBN, που βρίσκεται στο εξώνιο 19, όπου μια γουανίνη (G) αντικαθίσταται από μια αδενίνη (A). Η αλλαγή c2594G>A στο εσωτερικό του εξωνίου 19 οδηγεί στην αλλαγή Ser865Asn σε επίπεδο αμινοξικής αλληλουχίας, γεγονός που τροποποιεί ένα συντηρημένο αμινοξύ στον τομέα CUB4 της πρωτείνης. Από τα παραπάνω στοιχεία φαίνεται ότι η μετάλλαξη αυτή είναι η γενεσιουργός αιτία της νόσου στα συγκεκριμένα περιστατικά.
ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Στην εργασία αυτή, η ανάλυση γονοτύπου έδειξε ότι οι γονείς φέρουν ένα ταυτόσημο χρωμοσωμικό τμήμα στην περιοχή 10p12.1, για το οποίο είναι και οι δύο ετεροζυγώτες. Η ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο CUBN, το οποίο εδράζεται στην περιοχή 10p12.1, έδειξε ότι οι δύο γονείς είναι ετεροζυγώτες για την ίδια μετάλλαξη c2594G>A στο εξώνιο 19, η οποία οδηγεί στην σημαντική, σε επίπεδο αμινοξικής αλληλουχίας, αλλαγή Ser865Asn. Σε ό,τι αφορά στα πάσχοντα παιδιά, η μοριακή γενετική ανάλυση έδειξε ότι και τα δύο είναι ομοζυγώτες για μια σειρά μικροδορυφορικών δεικτών στην περιοχή 10p12.1, ενώ ταυτόχρονα είναι ομοζυγώτες για τη μετάλλαξη c2594G>A στο εξώνιο 19 του γονιδίου CUBN. Από τα παραπάνω, μπορούμε να συνάγουμε αφενός ότι η μετάλλαξη c2594G>A στο γονίδιο CUBN είναι η γενεσιουργός αιτία της νόσου στα περιστατικά αυτά, αφετέρου ότι οι γονείς των πασχόντων παιδιών κληρονόμησαν την χρωμοσωμική περιοχή 10p12.1 από κάποιον κοινό πρόγονο. Οι μεταλλάξεις που έχουν ανιχνευθεί στο γονίδιο CUBN παίζουν σημαντικό ρόλο στα επίπεδα έκφρασης, την λειτουργικότητα και την σταθερότητα της πρωτείνης, λόγω αλλαγών σε σημαντικά συντηρημένα αμινοξέα ή στον ρυθμό αποδόμησης του mRNA ή της ίδιας της πρωτείνης. Για να εκτιμηθεί ο ρόλος τον οποίον παίζει στην αιτιοπαθογένεια της νόσου η συγκεκριμένη μετάλλαξη που αναφέρουμε για πρώτη φορά σε αυτή την εργασία, έχουν αναληφθεί περαιτέρω μελέτες που βρίσκονται σε εξέλιξη.
Η μελέτη μεγάλων αριθμών ασθενών με νεανική μεγαλοβλαστική αναιμία είναι σημαντική προϋπόθεση προκειμένου να προσδιοριστεί η συμβολή της υποκείμενης μετάλλαξης στον φαινότυπο, καθώς και να γίνει δυνατή η επιτυχής διάκριση του κληρονομούμενου από τον επίκτητο τύπο της νόσου. Οι Tanner και συνεργάτες αναφέρουν έναν αριθμό 55 οικογενειών και σποραδικών ασθενών που παραπέμφθηκαν για ανάλυση μεταλλάξεων στηριζόμενοι σε κλινική υποψία κληρονομικής ανεπαρκείας της κοβαλαμίνης. Από αυτούς, μόνον οι 6 δεν είχαν μεταλλάξεις, γεγονός που οδήγησε στην ερμηνεία ότι η αποτυχία ανίχνευσης μετάλλαξης πιθανά συνεπάγεται επίκτητο τύπο ανεπαρκείας, ενδεχομένως και με διαφορετική μοριακή βάση.
Η παρούσα μελέτη περιγράφει τη διαφορική διάγνωση του συνδρόμου IGS από το οποίο φαίνεται ότι πάσχουν δύο αδελφάκια με μεγαλοβλαστική αναιμία και πρωτεϊνουρία, χρησιμοποιώντας μοριακή γενετική ανάλυση. Η εργασία αυτή συμβάλλει στην ταυτοποίηση της αιτιοπαθογένειας της νόσου με την καθιέρωση μιας νέας στρατηγικής η οποία αντιμετωπίζει το πρόβλημα της διαφορικής διάγνωσης μεταξύ συνδρόμων που εμφανίζουν όμοια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως η πάθηση από ανεπάρκεια του ενδογενή παράγοντα (IFD) και το σύνδρομο ΙGS, ενώ γενετικά και βιοχημικά αποτελούν διαφορετικές οντότητες. Η διαφορική διάγνωση θα μπορούσε να γίνει με το τεστ Schilling, εφ’ όσον βέβαια πληρούνταν οι προϋποθέσεις αξιοπιστίας της μεθόδου, όπως ο αποκλεισμός άλλων συνδρόμων δυσαπορρόφησης, ειδικών λοιμώξεων, ειδικών διατροφικών συνηθειών και ειδικών καταστάσεων όπως σύνδρομο τυφλής έλικας. Όμως, το σχετικά υψηλό κόστος της τεχνικής καθώς και η δύσκολη κάποιες φορές αξιολόγηση των τιμών απορρόφησης της ραδιοκοβαλαμίνης έχουν περιορίσει ή σχεδόν καταργήσει την χρήση της στις περισσότερες χώρες.
Με τη χρήση της μεθόδου μοριακής διάγνωσης είναι πολύ πιθανό να αποδειχθεί ότι αμφότερα τα σύνδρομα ΙGS και ΙFD παρουσιάζουν συχνότητα εμφάνισης υψηλότερη αυτής που πιστεύεται. Ακόμα περισσότερο μάλιστα σε πληθυσμούς όπου οι γάμοι μεταξύ συγγενών είναι συχνοί. Κάτι σχετικό φαίνεται πως συμβαίνει στην οικογένεια με την οποία ασχοληθήκαμε στην παρούσα εργασία. Η παρουσία ενός εκτεταμένου τμήματος της περιοχής 10p12.1 σε ετεροζυγωτία και στους δύο γονείς, κάνει ιδιαίτερα πιθανό το ενδεχόμενο της κληρονόμησης του τμήματος αυτού από κάποιον κοινό πρόγονο, γεγονός που σημαίνει πως οι γονείς ήταν συγγενείς.
Παρ’ όλον ότι οι φαινοτυπικά όμοιες ανωτέρω παθολογικές καταστάσεις μπορούν εύκολα να αποκατασταθούν με την χορήγηση βιταμίνης Β12, εξακολουθεί να μην υπάρχει ακριβής διάγνωση γι’ αυτές. Όμως, η ερευνητική δραστηριότητα στο πεδίο της μοριακής διάγνωσης, στα πλαίσια της οποίας εντάσσεται και η παρούσα εργασία, συμβάλλει στην ανάπτυξη γενετικών τεστ, τα οποία παίζουν αποφασιστικό ρόλο στην άμεση και ασφαλή διάγνωση, αφού κάνουν δυνατή την ταυτοποίηση των διαταραχών σε μοριακό επίπεδο. Τέτοιου είδους ευρήματα αποτελούν σημαντικές πληροφορίες για τους κλινικούς γιατρούς, σε ότι αφορά στον καλύτερο θεραπευτικό χειρισμό κάθε περιστατικού, αφού η γρήγορη και σωστή διάγνωση μπορεί να τροποποιήσει τον χρόνο έναρξης αλλά και την θεραπεία με κοβαλαμίνη στο σύνολό της.
Πάνος Πουλόπουλος
Δεν υπάρχουν σχόλια:
Δημοσίευση σχολίου